Mokėsi Antalieptėje, 1887–1892 m. Daugpilio realinėje gimnazijoje. 1892–1900 m. (su pertrauka 1893–1895 m.) studijavo Peterburgo dvasinėje katalikų akademijoje, 1900 m. kovo 4 d. įšventintas kunigu. 1900–1901 m. Varaklianų (Latvija) katalikų parapijos vikaras, 1901–1910 m. Bikavos Švč. Jėzaus Širdies (Latvija) katalikų parapijos klebonas.
1910–1929 m. gyveno Sankt Peterburge (nuo 1924 m. Leningradas). 1910–1911 m. atliko bausmę vienuolyne. 1911–1914 m. Šv. Kotrynos bažnyčios vikaras. 1914–1923 m. Švč. Jėzaus Širdies parapijos klebonas, čia pastatydino bažnyčią. 1923 m. atsisakęs valdžiai atiduoti brangius bažnytinius reikmenis su vyskupu Jonu Ciepliaku ir kitais 15 Petrogrado katalikų kunigų Maskvoje komunistų valdžios nuteistas 3 m. kalėti. 1925 m. amnestuotas, grįžo į parapiją Leningrade. 1929 m. vasario 9 d. nominuotas ir slapta konsekruotas tituliniu Matregos vyskupu, įgaliotas vadovauti Leningrado tikintiesiems. Už neva antitsovietinę veiklą SSRS saugumo tardytas, 1930 m. nuteistas 10 m. kalėti griežtojo režimo Solovkų lageryje.
1933 m. rudenį grąžintas į Lietuvą, gyveno Kaune, talkino Kauno arkivyskupui Juozapui Skvireckui pastoracijos darbuose. 1934 m. lankėsi Romoje pas popiežių Pijų XI. 1934–1936 m. gyveno JAV. Nuo 1937 m. benediktinių bažnyčios Kaune rektorius; čia įsteigė nuolatinę Švč. Sakramento adoraciją. 1940 m. gegužės-birželio mėn. Lietuvos kariuomenės vyr. kapelionas. Nuo 1943 m. Kaišiadorių vyskupas. Gynė Bažnyčios ir tikinčiųjų teises, aktyviai dalyvavo pasipriešinimo SSRS okupaciniam režimui veikloje, raštu protestavo prieš kunigų areštus, reikalavo leisti dėstyti tikybą mokyklose, buvo griežtas kunigų drausmės klausimais.
1946 m. SSRS okupacinės valdžios areštuotas, beveik metus laiko kalintas ir tardytas Vilniaus KGB rūmų rūsiuose, 1947 m. rugsėjo 27 d. Maskvoje nuteistas 7 m. kalėti, konfiskuotas visas jo turtas. 1947–1948 m. kalintas Oršoje, 1948 m. išvežtas į Vladimiro kalėjimą, 1953 m. kaip sunkus ligonis apgyvendintas Zubovo Polianos (Mordovija) neįgaliųjų namuose. 1956 m. grįžo į Lietuvą, bet sovietų valdžia jam neleido valdyti vyskupijos. 1957 m. Birštone slapta konsekravo vyskupu kanauniką kunigą Vincentą Sladkevičių. 1958 m. sovietų valdžios ištremtas į Šeduvą, iš čia slapta nuo valdžios rūpinosi savo vyskupijos reikalais. 1962 m. vasario 9 d. popiežius Jonas XXIII suteikė arkivyskupo titulą. Mirė 1962 m. rugpjūčio 20 d. po rugpjūčio 17 d. SSRS saugumo jo bute atliktos kratos ir nenustatytų vaistų injekcijos. Palaidotas Kaišiadorių katedros kriptoje. 1990 m. pradėta jo beatifikacijos byla, 2008 m. baigta, dokumentai įteikti Šventųjų skelbimo kongregacijai.
2016 m. gruodžio 1 d. popiežius Pranciškus įgaliojo Šventųjų skelbimo kongregaciją paskelbti dekretą, pripažįstantį Dievo tarno arkivyskupo Teofiliaus Matulionio (1873-1962) kankinystę ir taip atveriantį kelią jo paskelbimui palaimintuoju.